綠色熒光蛋白嵌合體小鼠的建立和鑒定

日期：2025-09-04 05:35

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摘要：

摘　要　為研究嵌合體動(dòng)物中供體胚胎干細(xì)胞( ES) 在宿主胚胎發(fā)育中的走向和定位, 同時(shí)探討綠色熒光蛋白(GFP)基因作為報(bào)告基因在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作中的應(yīng)用價(jià)值, 本研究將p EGFP2N1 基因?qū)胄∈驟S2D3細(xì)胞系,得到穩(wěn)定表達(dá)GFP的胚胎干細(xì)胞亞系ES2D32GFP , 通過(guò)對(duì)昆明小鼠的囊胚腔注射, 獲得了4只表達(dá)綠色熒光蛋白的嵌合體小鼠。其中1 只存活至成年,3 只出生時(shí)死亡。熒光顯像及組織PCR檢測(cè)顯示了綠色熒光蛋白在小鼠體內(nèi)的嵌合情況。以綠色熒光為指標(biāo)可實(shí)現(xiàn)活體水平的動(dòng)態(tài)觀察,本實(shí)驗(yàn)**觀察到以GFP為指標(biāo)所示的機(jī)體嵌合情況與根據(jù)毛色嵌合推測(cè)的機(jī)體嵌合情況存在很大差異, 以GFP 為嵌合指標(biāo)更加**而準(zhǔn)確;但不排除GFP對(duì)小鼠發(fā)育存在一定毒性的可能; 另外, 有結(jié)果顯示供體ES 細(xì)胞在宿主體內(nèi)除了大片補(bǔ)丁狀嵌合外,還存在細(xì)胞散在嵌合的情況,后者提示了在組織中利用GFP 對(duì)ES細(xì)胞實(shí)施單細(xì)胞追蹤和實(shí)時(shí)觀察的可行性,為胚胎發(fā)育和**發(fā)生的相關(guān)研究提供了新的觀察方法..
　
ES 細(xì)胞介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物制作途徑建立于1986 年( Robert son et al. , 1986 ; Gossleretal.1986) , 嵌合體動(dòng)物的獲得是實(shí)現(xiàn)ES 細(xì)胞途徑的決定性步驟(Auerbach et al. , 2000),其中一個(gè)重要問(wèn)題是嵌合狀態(tài)的分析, 即如何將嵌合體中ES來(lái)源部分同宿主部分區(qū)別開(kāi)來(lái)。*初用毛色作為嵌合指標(biāo),但此方法對(duì)內(nèi)臟的嵌合無(wú)法分析(Hooper etal. , 1987 ; Nagyet al. , 1993) , 現(xiàn)在常用LacZ 報(bào)告基因法( Yvan and Philippe , 1990 ; Suemorietal. , 1990 ; Woodet al. , 1993) 和GPI 同功酶電泳法(Nagy et al. , 1993 ;Beddington andRobert son ,1989) 標(biāo)記ES 細(xì)胞, 可以檢測(cè)內(nèi)臟的嵌合, 卻需破壞機(jī)體致其死亡,無(wú)法對(duì)同一活體進(jìn)行動(dòng)態(tài)研究,而且檢測(cè)技術(shù)要求高, 方法復(fù)雜。GFP 作為一種獨(dú)特的報(bào)告蛋白,無(wú)需抗體、輔助因子、酶底物等其他成分的參與,在熒光顯微鏡的藍(lán)光激發(fā)下, 發(fā)出綠色熒光(Chalfie et al. , 1994),其*大優(yōu)點(diǎn)在于它在活細(xì)胞內(nèi)的示蹤作用。建立綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,可以在熒光顯微鏡下透過(guò)皮膚見(jiàn)到高強(qiáng)度熒光,達(dá)到在活體水平上對(duì)內(nèi)臟嵌合進(jìn)行直接觀察的目的, 克服了以往方法的缺點(diǎn)。英國(guó)和加拿大實(shí)驗(yàn)室(Zerncka2Goetz et al., 1997 ; Ha2diantonakis et al. , 1998) 將表達(dá)GFP的ES 細(xì)胞
與8 - 16 細(xì)胞期胚胎聚合, 得到綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,但未對(duì)出生嵌合體小鼠的嵌合狀態(tài)進(jìn)行系統(tǒng)分析。國(guó)內(nèi)在對(duì)ES細(xì)胞和嵌合體制作取得一定研究基礎(chǔ)后(冼美薇等, 1996 ; 陳偉勝等,1999 ;**等, 2001 ; 馬蕓、陳系古,2002) , 近年來(lái)開(kāi)始將GFP 基因引入ES 細(xì)胞( 楊樺、傅繼良,2001 ;沈干等,2003) 。通過(guò)ES途徑建立表達(dá)GFP 的嵌合體小鼠在國(guó)內(nèi)尚未見(jiàn)報(bào)道。我們將p EGFP2N1 基因轉(zhuǎn)入D3 小鼠ES細(xì)胞, 并進(jìn)行ES細(xì)胞囊胚腔注射,得到ES 細(xì)胞介導(dǎo)的存活綠色熒光嵌合體小鼠, 以GFP 為報(bào)告蛋白對(duì)ES 細(xì)胞的嵌合情況進(jìn)行觀察,同時(shí)進(jìn)行未轉(zhuǎn)染GFP基因的ES2D3 細(xì)胞囊胚腔注射, 以此為對(duì)照, 探討GFP基因在小鼠體內(nèi)表達(dá)的**性。

1 　材料與方法

111 　材料

11111 　實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和細(xì)胞系　
ES2D3 細(xì)胞系, 昆明小鼠由中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供; 小鼠胚胎呈纖維細(xì)胞(MEF) 取自孕1215 d 昆明小鼠胚胎。

11112 　實(shí)驗(yàn)試劑　
綠色熒光蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒p EGFP2N1 (N1 末端改進(jìn)型熒光蛋白載體) 為Clontech公司產(chǎn)品;Lipofectin轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自GBICO 公司, Bam H Ⅰ限制性內(nèi)切酶試劑盒(目錄號(hào)MR0521)、RNaseA購(gòu)自華美生物工程公司,DL15000Markers 試劑盒購(gòu)自大連寶生物公司;DMEM 培養(yǎng)基和L IF購(gòu)自GBICO公司胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司; 胰酶、M16 、M2 培養(yǎng)液購(gòu)自SIGMA 公司。

112 　方法

11211 　ES2D32GFP 細(xì)胞的建立和培養(yǎng)　采用脂質(zhì)體介導(dǎo)法用質(zhì)粒p EGFP2N1(N末端改進(jìn)型熒光蛋白載體Clontech 公司) 轉(zhuǎn)染ES2D3 細(xì)胞。將10 μl質(zhì)粒p EGFP2N1、Lipofectin分別溶于100μl 80μl
無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基中, 混合后加入800μl 無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基混勻, 滴加至ES2D3 細(xì)胞上, 加入轉(zhuǎn)染液后于37℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)5 h 。棄轉(zhuǎn)染液, 換ES 培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)(培養(yǎng)液為葡萄糖含量4 500 mg/ L 的DMEM 添加20%FBS、β2巰基乙醇011 mmol/ L 、L IF 1 000 IU/ ml、青霉素100IU/ ml 、鏈霉素100IU/ml) 。48 h 后消化接種至經(jīng)MMC 處理過(guò)的MEF 上, 繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后, 用濃度為300μg/ ml G418的ES細(xì)胞培養(yǎng)液篩選抗性克隆, 倒置熒光顯微鏡下挑取熒光*強(qiáng)的克隆, 命名為ES2D32GFP 細(xì)胞, 進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。

11212 　ES2D32GFP 細(xì)胞未分化狀態(tài)及多能性的鑒定?、賶A性磷酸酶檢測(cè)　采用Gomoriα2萘基磷酸
法進(jìn)行染色。②體內(nèi)成瘤實(shí)驗(yàn)　將含有1 ×106 個(gè)ES 細(xì)胞懸液011 ml 接種于4 - 6周齡雄性裸小鼠腹股溝皮下,待腫物形成約5 周時(shí)處死裸鼠, 摘取腫物, 制作冰凍切片于熒光顯微鏡下觀察,常規(guī)石蠟切片HE染色作為對(duì)照。③體外胚體形成實(shí)驗(yàn)　將ES 細(xì)胞消化成單細(xì)胞懸液, 加不含L IF的培養(yǎng)液在玻璃培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng),每天搖晃培養(yǎng)瓶多次。

11213 　囊胚的收集　注射用囊胚取自四周齡超排昆明母小鼠, 與同品系公鼠合籠, 見(jiàn)栓315 d (當(dāng)日見(jiàn)栓為015d)時(shí)從**和輸卵管中收集胚胎,移入上覆石蠟油的M 16 培養(yǎng)液滴內(nèi), 于37 ℃、5 % CO2 孵箱內(nèi)培養(yǎng)。

11214 　囊胚腔注射?、?實(shí)驗(yàn)組　注射用細(xì)胞為ES2D3 細(xì)胞系轉(zhuǎn)染GFP 基因后傳代至7 - 15 代。
②對(duì)照組　注射用細(xì)胞為未轉(zhuǎn)染GFP 基因的ES2D3 細(xì)胞系在本實(shí)驗(yàn)室傳代至15 - 25 代。注射前3h更換新鮮培養(yǎng)液,胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液備用。將適量ES 細(xì)胞懸液和囊胚期胚胎移入M2 注射液滴內(nèi), 在顯微注射系統(tǒng)下,用持卵針固定囊胚,用注射針吸取ES 細(xì)胞, 從遠(yuǎn)離內(nèi)細(xì)胞團(tuán)的滋養(yǎng)層部位進(jìn)針, 每個(gè)囊胚注射ES 細(xì)胞10 - 12 個(gè)。

11215 　嵌合胚胎的發(fā)育　注射后囊胚腔消失, 置于培養(yǎng)液中于孵箱中培養(yǎng)1 - 3 h , 待囊胚腔恢復(fù)后, 移入見(jiàn)栓215d的假孕母鼠**中進(jìn)行培育。

11216 　熒光成像　將注射后胚胎、出生小鼠、置于倒置熒光顯微鏡載物臺(tái)上進(jìn)行熒光觀察。對(duì)于出
生后即死亡的嵌合體小鼠, 取部分部位做冰凍切片, 切片厚度20 μm。使用共聚集熒光顯微鏡觀察, 激發(fā)波長(zhǎng)488 nm,發(fā)射波長(zhǎng)507 nm。

11217 　PCR 檢測(cè)　存活小鼠死亡后, 在其各臟器中隨機(jī)部分取材, 提取基因組DNA , 通過(guò)PCR 檢測(cè)GFP基因。以質(zhì)粒pEGFP2N1 為模版, 設(shè)計(jì)引物P1 , 5′AAG TTA ACA TGG TGA GCA AGGGCG AGG3′; P2 ,5′AAC CTC TAC AAA TGTGGT ATG GCT G 3′, 擴(kuò)增基因片段大小約為840bp。反應(yīng)條件為95 ℃45 s , 56 ℃ 45 s , 72 ℃ 1min , 28 個(gè)循環(huán), PCR 產(chǎn)物以2%的瓊脂糖電泳觀察。

2 　結(jié)　果

211 　ES2D32GFP 細(xì)胞系的鑒定

ES2D32GFP 克隆在倒置光鏡下呈島嶼狀隆起,邊緣整齊, 表面平滑, 結(jié)構(gòu)致密,細(xì)胞間界限不清;熒光顯微鏡下可見(jiàn)克隆發(fā)出較強(qiáng)綠色熒光, 表面熒光強(qiáng)度均勻(圖版Ⅰ: 1A , 1B) ,傳代后熒光強(qiáng)度未見(jiàn)衰減;消化成單細(xì)胞懸液后, 細(xì)胞小、圓而亮, 幾乎所有單個(gè)ES 細(xì)胞均發(fā)出綠色熒光(圖版Ⅰ: 2A , 2B)。
ES2D32GFP 堿性磷酸酶染色陽(yáng)性, 細(xì)胞克隆呈深黑色。成瘤實(shí)驗(yàn)中,畸胎瘤顯示綠色熒光,腫瘤組織含有來(lái)源于三個(gè)胚層的多種細(xì)胞類型。胚體形成實(shí)驗(yàn)中, 3 - 5 d 細(xì)胞團(tuán)開(kāi)始分層, 形成簡(jiǎn)單類胚體,外層細(xì)胞大而松散,內(nèi)層細(xì)胞小而緊密,6 - 12 d 分層增多, 出現(xiàn)囊胚腔, 成圓泡狀, 熒光顯微鏡下見(jiàn)整個(gè)胚體發(fā)出綠色熒光,胚體貼壁培養(yǎng)后2 -3 d , 細(xì)胞團(tuán)周邊可自發(fā)分化為多種形態(tài)的細(xì)胞, 分化后胚胎仍有強(qiáng)熒光顯示。

212 　ES 細(xì)胞囊胚腔注射和嵌合體小鼠的建立

ES 細(xì)胞囊胚腔注射(圖版Ⅰ: 3A , 3B) , 后于熒光顯微鏡下觀察,實(shí)驗(yàn)組所有胚胎均有細(xì)胞顯示綠色熒光,對(duì)照組未見(jiàn)熒光。注射后囊胚腔消失,培養(yǎng)1 - 3 h 后部分胚胎囊胚腔恢復(fù),移植入假母**中繼續(xù)發(fā)育, 孕期18 d左右。對(duì)囊胚存活率和產(chǎn)仔率用χ2 檢驗(yàn)做統(tǒng)計(jì)學(xué)分析, 結(jié)果顯示, 轉(zhuǎn)染GFP基因組囊胚存活率和產(chǎn)仔率明顯低于未轉(zhuǎn)染GFP 基因組,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義( P1 < 0101 , P2 <0101) 。

213 　嵌合體小鼠的熒光顯像

將剛出生小鼠置于熒光顯微鏡下觀察, 以未經(jīng)操作的同齡昆明小鼠作為對(duì)照。鏡下可見(jiàn)實(shí)驗(yàn)組中有4 只小鼠發(fā)出綠色熒光, 1 只存活,3只出生時(shí)死亡。4 只小鼠均在頭頸部、胸部、腹部、肢體部位發(fā)出綠色熒光,綠色部分呈塊狀或線條狀嵌合在未發(fā)光的黑暗部位中,對(duì)照組未見(jiàn)熒光(圖版Ⅰ:4A , 4B) 。

214 　對(duì)存活嵌合體小鼠的觀察

存活的綠色熒光蛋白嵌合體小鼠在熒光鏡下發(fā)出明亮的綠色熒光,熒光部位分布在其頭部、胸部、腹部和尾尖。當(dāng)此小鼠長(zhǎng)毛后,在其頭頂部呈現(xiàn)一塊不規(guī)則形黑**斑, 胡須中有2 根為黑色,呈現(xiàn)出ES細(xì)胞來(lái)源的D3 小鼠毛色的嵌合,頭頂部的毛色嵌合位置與熒光顯微鏡下所見(jiàn)之綠色部位吻合(圖版Ⅰ: 5A , 5B)。此小鼠生長(zhǎng)發(fā)育遲緩,三周齡時(shí),體重、生長(zhǎng)僅為同齡普通昆明小鼠的一半, 且前肢短小, 步態(tài)搖擺, 尾部?jī)商幣で? 根部增粗,顯示有畸形發(fā)育。8 周齡時(shí),與成年普通明母鼠1∶2 合籠, 但未見(jiàn)生育跡象。因被毛的折光對(duì)熒光成像的干擾,小鼠長(zhǎng)毛后頭、胸、腹部的顯像受到影響,但被毛較少的尾尖在熒光顯微鏡下依然可見(jiàn)強(qiáng)烈的綠色熒光。小鼠出生四個(gè)月后死亡, 對(duì)其進(jìn)行解剖,取各臟器于熒光顯微鏡下觀察,在腦、心、肺、肝、腸、腎、睪丸、肢體肌肉中均見(jiàn)綠色熒光部位的嵌合。
3 　討　論

本實(shí)驗(yàn)成功獲得了綠色熒光蛋白嵌合體小鼠,以熒光為指標(biāo)在活體水平上對(duì)內(nèi)臟嵌合狀態(tài)進(jìn)行直接觀察。

外源ES 細(xì)胞在宿主胚胎中以單細(xì)胞嵌合的方式提示我們, 在胚胎發(fā)育和**發(fā)生的研究中, 可以利用GFP對(duì)ES細(xì)胞實(shí)施單細(xì)胞追蹤和實(shí)時(shí)觀察, 研究其分化或病變情況。此外, 如果證實(shí)在生殖系的嵌合中也存在外源ES細(xì)胞單細(xì)胞嵌合的情況,則以往對(duì)生殖系嵌合的檢查方法必須重新評(píng)估。值得指出的是, 對(duì)存活的嵌合體小鼠的觀察發(fā)現(xiàn),以GFP為指標(biāo)所示的機(jī)體嵌合情況與根據(jù)毛色嵌合推測(cè)的機(jī)體嵌合情況存在很大差異。以往認(rèn)為,從外觀毛色的嵌合可以推斷內(nèi)臟的嵌合情況,兩者之間存在正比關(guān)系,如果沒(méi)有毛色的嵌合則一定沒(méi)有內(nèi)臟的嵌合(Hooper et al. ,1987) , 在我們的實(shí)驗(yàn)中, 小鼠毛色的嵌合僅見(jiàn)于頭部,而熒光所示除了頭部相應(yīng)的嵌合以外,在胸、腹、尾尖多處部位也存在來(lái)源于供體ES 細(xì)胞的組織的嵌合,這提示了單純以毛色的嵌合來(lái)判斷機(jī)體的嵌合狀態(tài)存在一定的局限性,以GFP 為指標(biāo)則更加**而準(zhǔn)確.（摘自動(dòng)物學(xué)報(bào)）

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